双靶向诱导超抗原TSST-1基因重组逆转录病毒的包装及鉴定

目的包装出携5拷贝缺氧反应元件(5 HRE)增强子和癌胚抗原启动子(CEAp)联合调控的超抗原中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)基因的逆转录病毒,并建立稳定表达TSST-1的人结肠癌Lovo细胞株。方法应用已构建好的逆转录病毒载体pLEGFP-N1-5 HRE-CEAp-TSST-1-linker-CD80TM,与辅助质粒pMB-MLV、pMB-G共转染入293T细胞,LaSRT法检测病毒滴度。包装出的逆转录病毒感染CEA阳性的人结肠癌细胞株Lovo和CEA阴性的人宫颈癌细胞株Hela。应用RT-PCR和免疫组化方法鉴定TSST-1的表达。结果获得重组逆转录病毒滴度约为1×106CFU/mL。RT-PCR及免疫组化证实经病毒感染的Lovo细胞在mRNA和蛋白水平均有TSST-1表达,缺氧环境中的mRNA表达量更高,且细胞传代20次后依然有TSST-1 mRNA表达;经病毒感染的Hela细胞在常氧或缺氧状态下均无TSST-1 mRNA及蛋白表达。结论包装出较高滴度重组逆转录病毒,并能靶向性在CEA阳性肿瘤内稳定表达TSST-1,为后续检验TSST-1对肿瘤的杀伤效应奠定了基础。     

通用腺伴随病毒载体的构建及表达报告基因GFP的实验研究

目的构建基因治疗通用型腺伴随病毒(AAV)载体并检测其转染外源基因作用。方法使用限制性内切酶切除pSSV9int质粒中的AAV病毒Rep和Cap基因元件后,插入了重组腺病毒专用穿梭质粒-pACCMVpLpA的含有CMV启动子、多克隆位点(MCS)和多聚腺苷酸信号(PolyA)的表达盒,构建了重组AAV通用载体质粒pSSHG-CMV。在该质粒MCS插入绿色荧光蛋白(GFP)基因后,使用pSSHG-CMV-GFP、GFP140和pAAV/Ad三种质粒共转染293包装细胞,制备GFP重组AAV。应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度,并将该病毒感染新生大鼠NIH3T3细胞,荧光显微镜观察GFP表达。结果重组AAV的滴度在浓缩前可达2×1011cfu/mL,浓缩后可达2×1013cfu/mL,表明成功地构建了重组AAV载体。插入外源基因GFP后,在包装病毒和辅助质粒的联合作用下,能产生具有感染性的重组AAV。感染了重组GFP-AAV的大鼠NIH3T3细胞表达了明显的GFP荧光。结论构建的重组AAV通用载体pSSHG-CMV可转染外源基因,这为进一步的基因治疗奠定了基础。     

构建及鉴定携带角蛋白启动子和人乳头瘤病毒16E6/E7基因的重组腺病毒

目的利用AdEasy系统构建携带人角蛋白启动子的人乳头瘤病毒-16(HPV-16)E6/E7基因重组腺病毒,并通过RT-PCR方法检测E6/E7基因的表达。方法应用PCR方法从含有HPV-16全基因序列的质粒上扩增E6/E7基因,构建pCDNA3.1(-)-K14-E6/E7-polA载体,扩增、酶切获得K14-E6/E7-polA片段插入腺病毒穿梭载体质粒pAdTrack上,构建重组穿梭载体pAdTrack-K14-E6/E7-polA,线性化后与骨架载体AdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组得到腺病毒质粒pAd-K14-E6/E7-polA,经人胚肾293细胞包装后得到重组腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA。氢化铯(CsCl)梯度离心纯化病毒,提取病毒再感染后的293细胞总RNA,通过RT-PCR方法检测E6/E7基因的表达。结果通过同源重组的方法构建了腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA载体,经酶切和测序鉴定该质粒构建成功。293细胞包装3d后观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达,CsCl梯度离心纯化最终获得7.2×1010pfu/mL滴度的重组病毒;用该滴度病毒重新感染293细胞3d后,提取细胞总RNA,RT-PCR检测E6/E7有表达。结论利用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和E6/E7的重组腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA。这将为进一步研究HPV-16E6/E7基因功能及利用基因治疗女性宫颈癌奠定了基础。     

人脑源性神经营养因子重组腺伴随病毒的制备

目的　构建并产生人脑源性神经营养因子 (humanbrain derivedneurotrophicfactor ,hBDNF)重组腺伴随病毒(adeno associatedvirus,AAV)载体。方法　将目的基因hBDNF插入载体质粒pSSHG Neo的EcoRI BamHI位点 ,构建重组质粒pSSHG Neo/hBDNF。用腺病毒辅助质粒 pFG14 0代替野生型腺病毒 ,包装质粒 pAAV/Ad及已构建的重组质粒 ,三质粒磷酸钙共沉淀法转染 80 %融合的 14 3细胞系 ,包装AAV hBDNF。经蔗糖梯度离心法纯化、斑点杂交方法测定重组病毒滴度。结果　重组病毒AAV hBDNF滴度约为 4 .86× 10 14 颗粒·L-1。结论　成功制备了重组病毒AAV hBDNF ,为神经退行性疾病基因治疗实验奠定了基础     

缺氧诱导的肿瘤特异性基因治疗载体的靶向性鉴定

目的检测本课题组已构建的缺氧诱导的hTERT基因启动子(5HRE-hTERTp)调控的基因表达载体调控元件的肿瘤特异性和对缺氧诱导的反应性。方法 MTT法检测不同浓度(100、200、300、400、500μmol/L)CoCl2对LoVo细胞活力以及增殖的影响。收集前期已包装成功的缺氧反应元件(hypoxia-response elements,HRE)和人端粒酶催化亚单位启动子hTERTp联合调控CDX2表达的慢病毒表达载体pLVX-5HRE-hTERTp-CDX2-3FLAG(5HhC)病毒液,感染hTERT+LoVo细胞及hTERT-HK-2细胞,细胞免疫组化法验证该治疗载体的靶向性;复苏前期筛选的稳定表达5HhC的LoVo细胞(5HhC/LoVo),用缺氧模拟剂CoCl2模拟缺氧微环境,Western blot和RT-PCR分别检测缺氧调控下CDX2的表达水平。结果结肠癌细胞株LoVo在不同浓度CoCl2环境下随缺氧时间的延长,细胞活力及增殖均受到抑制,在高浓度(300、400、500μmol/L)作用下抑制效果更加明显;5HhC病毒成功感染hTERT+LoVo细胞,而在hTERT-HK-2细胞中不表达;Western blot和RT-PCR证实缺氧可上调5HhC/LoVo细胞中CDX2蛋白和mRNA的表达,且在300μmol/L CoCl2作用24h其蛋白表达量最高。结论缺氧微环境可明显上调hTERTp靶向性的治疗载体5HhC中抑癌基因CDX2的表达。     

人骨形态发生蛋白-7重组腺病毒载体的构建

目的为了研究人骨形态发生蛋白-7(hBMP7)导入骨缺损模型中的治疗作用,构建重组腺病毒载体。方法将hBMP7基因全长定向克隆入穿梭质粒pACCMV-plpA,构建pACCMV/rhBMP7穿梭质粒,应用磷酸钙-DNA共沉法将穿梭质粒及包装质粒PJM17共转染293细胞,经细胞内同源重组后,构建骨形态发生蛋白-7重组腺病毒Ad pAC-CMV/rhBMP7。结果成功构建了重组质粒pACCMV/rhBMP7,经293细胞包装后,扩增纯化测定病毒滴度为1×1011pfu/mL。结论成功构建人骨形态发生蛋白-7重组腺病毒Ad pACCMV/rhBMP7,为骨缺损、骨不连的基因治疗奠定了基础。     

人神经菌毛素-1基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建含有人神经菌毛素-1(NRP-1)基因和3Flag标签蛋白基因的腺病毒载体,为研究该基因对肿瘤细胞与其周围间质细胞的相互作用的影响提供实验基础。方法应用AgeⅠ和NheⅠ限制性内切酶酶切含有人NRP-1基因的质粒,再将其与酶切线性化的pDC315-3Flag载体片段连接,构建穿梭质粒pDC315-NRP-1-3Flag;应用腺病毒骨架质粒pBHGlox△E13Cre与此穿梭质粒共转染HEK293细胞,产生重组腺病毒,进而对重组腺病毒进行扩增、纯化及滴度测定;用PCR和基因测序方法验证穿梭质粒pDC315-NRP-1-3Flag的构建;再通过荧光显微镜和Western blot方法,分别检测质粒pDC315-NRP-1-3Flag和重组腺病毒转染HEK293细胞后NRP-1蛋白的表达情况。结果经PCR和测序分析,证实穿梭质粒pDC315-NRP-1-3Flag与设计一致;穿梭质粒pDC315-NRP-1-3Flag和重组腺病毒分别转染HEK293细胞后,经Western Blot均检测出在95¹30ku处有条特征带,其大小和NRP-1-3Flag融合蛋白(104ku)相吻合;滴度测定为2.00E+11PFU/mL。结论成功构建了人NRP-1基因重组腺病毒载体,并能在HEK293细胞中表达。     

人TSHR A亚单位重组腺相关病毒2/9载体的构建及鉴定

目的构建人促甲状腺素受体(TSHR)A亚单位重组腺相关病毒2/9杂合载体(rAAV2-9-hTSHR289-IRES-ZsGreen),为研究格雷夫斯病建立理想动物模型和探索基因预防提供更佳手段。方法以EcoRⅠ和BamHⅠ将腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-ZsGreen和含hTSHR289的pDC315质粒双酶切,回收酶切病毒骨架质粒及目的片段进行连接,产物转化JM109感受态细菌,获取重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen。经酶切电泳、测序鉴定后,将pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen、辅助质粒pHelper、包装质粒pAAV-2/9(AAV2-Rep,AAV9-Cap)采用磷酸钙法转染293AAV细胞系,获取大量rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen,经纯化后荧光显微镜下观察其包装效率,rQ-PCR法测定病毒滴度。将rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen感染HEK293细胞,ELISA法检测不同时间点hTSHR289蛋白表达水平。结果重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-hTSHR289-IRES-ZsGreen经双酶切及测序鉴定,质粒构建正确;荧光显微镜下观察显示转染293AAV细胞72 h,病毒包装效率达92%～94%,rQ-PCR法测定的rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen病毒滴度为1×10~(13)vg/mL;ELISA法显示rAAV2/9介导的hTSHR289蛋白表达96 h明显高于72 h及48 h。结论成功构建rAAV2/9-hTSHR289-IRES-ZsGreen重组腺相关病毒载体并能有效转染和表达。     

小鼠肌肉组织特异性微小RNA miR-133a腺病毒表达载体的构建及表达

目的制备小鼠肌肉组织特异性微小RNA miR-133a的腺病毒表达载体并观察其在HeLa细胞的表达。方法利用PCR技术从小鼠基因组DNA扩增miR-133a前体对应的基因组片段,克隆到质粒pAdTrack-CMV,而后以同源重组的形式插入到腺病毒表达载体,由人胚肾293细胞包装,获得有感染能力的重组腺病毒颗粒。重组腺病毒感染HeLa细胞后,利用Northern blot检测miR-133a成熟分子的表达。结果①成功构建穿梭质粒pAdTrack-miR-133a;②成功构建重组腺病毒质粒pAdeasy-miR-133a;③293细胞包装获得有感染能力的重组腺病毒;④转染的HeLa细胞能够高效表达成熟miR-133a。结论构建了小鼠miR-133a的腺病毒表达载体,证实其转染HeLa后的表达,为后续研究miR-133a的功能打下了基础。     

携带NT4-AcSDKP融合基因重组腺相关病毒载体的构建

目的构建携带NT4-AcSDKP融合基因的重组腺相关病毒,为探讨AcSDKP(乙酰化-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸)的多样化功能提供基础。方法以质粒载体pGEM-T Easy/NT4为模板,PCR技术获得NT4-AcSDKP基因片段,插入腺相关病毒载体穿梭质粒pSSHG-CMV,构建重组质粒pSSCMV-NT4-AcSDKP。用腺病毒全基因组质粒pFG140、辅助质粒pAAV/Ad和已构建的重组质粒,三质粒磷酸钙共沉淀法转染80%融合的293细胞,包装rAAV-NT4-AcSDKP,RT-PCR方法测定重组腺相关病毒滴度。结果成功合成NT4-AcSDKP基因,构建重组质粒pSSCMV-NT4-AcSDKP,包装获得滴度为3.40×1010 copies/mL的重组腺相关病毒。结论成功获得表达AcSDKP重组腺相关病毒,为抗炎、抗纤维化、器官修复等方面的进一步研究奠定了基础。     

隧道出渣设备最佳配合分析

针对隧道出渣时,装载机与倾卸车联合作业中的配合问题进行了深入的研究,分析并建立两种施工机械最佳配合关系的数学模型,通过实例计算表明,此模型及算法对施工单位在隧道施工中合理地确定两者数量关系具有一定的指导意义.     

中国经济增长的波动分析

对国民经济增长的波动进行计算分析。应用Mexican Hat小波对国内生产总值（GDP）的增长率进行多时间尺度分析，再利用宏观经济学的理论从政府宏观调控政策、投资、消费等方面分析引起波动的原因。在不同时间尺度下，经济波动受到政策、投资和消费及重大政治事件的影响。通过对经济增长波动的因素及规律的分析，可以提高对经济发展的预见性，促进经济更好的增长。     

钢筋混凝土简支梁桥梁体病害分析及维修方法

随着经济的发展、综合国力增强,交通事业日新越益发展,桥梁建设取得了长足的进步,为我国的各项事业的发展提供了坚强的基础,但随之而来的桥梁病害问题也日益严重,针对上述情况,本文将对钢筋混凝土简支梁桥梁体的常见病害进行归纳和总结,并提出一定的维修措施,以便能够减轻同类病害的发生,为今后的公路事业发展提供参考依据.     

高速公路采空区治理的监理

针对衡枣高速公路途径的采空区治理问题，介绍了采空区从勘探、治理到质量检验全过程的监理工作。描述了采空区的治理情况和监理工作思路、方法，指出了采空区治理监理工作中应把握的工作要点。     

速腾轿车蓄电池亏电故障检修

一辆搭载BPL型发动机的一汽大众速腾1．8L轿车,该车在停放时偶尔会发出“嗡嗡的异响”,并出现发动机无法启动的故障现象。经检查,发现车辆熄火后冷却风扇偶尔会自行运转。结合其电源管理系统,通过分析冷却风扇的工作原理及电路图,发现故障是由于主继电器的不正常吸合引起的,更换主继电器,故障排除。     

Assessment of Quality of Service of Virtual Knowledge Communities

An assessment method for the quality of service (QoS) of virtual knowledge communities (VKC) is proposed based on fuzzy theory and analytic hierarchy process (AHP). The QoS is evaluated in terms of Website design, reliability, responsiveness, trust,personalization, and information quality. The cognitive QoS and the QoS evaluated by assessors are compared to analyze which QoS of the VKC should be improved urgently and which indicators keep leading positions, and to assist administrators of the VKC on measuring and understanding current status and implementation effect of the QoS.     

聚丙烯纤维混凝土配合比均匀性研究

聚丙烯纤维混凝土以其独有的特点,越来越得到广泛的应用.介绍了利用均匀设计法对聚丙烯纤维混凝土的配合比进行优化分析的过程,选取水泥、速凝剂掺量、聚丙烯纤维掺量三个影响因素,对混凝土配比试件的试验数据统计结果进行回归分析,结果表明,在设定试验条件下,在每立方米混凝土中掺入0.9kg聚丙烯纤维的方案是比较合理的.     

纳米Ni粉对Cu粉末烧结性能的影响

研究了纳米Ni粉对Cu粉末烧结性能的影响。研究表明：由于添加1％纳米Ni粉中的NiO未被完全还原,而且纳米Ni粉本身还有被CuO氧化成NiO的可能,因而纳米Ni粉在Cu粉末烧结过程中未能起到活化烧结的作用。相反,添加1％纳米Ni粉后还降低了Cu粉末烧结性能。     

级配对级配碎石力学性能影响试验分析

通过试验对不同级配的级配碎石强度影响因素进行分析,得出实际结论,为工程中级配选择提供借鉴.     

桥梁板式橡胶支座抗压弹性模量分析

简要介绍桥梁板式橡胶支座抗压弹性模量的计算及试验方法,同时从几个方面分析影响该指标的因素.